Encephalitozoonoza królików

Encephalitozoonoza (kunikuloza, EC) wywoływana jest przez wewnątrzkomórkowego pasożyta, należącego do grupy Mikrosporydia (Wasson, 2000). Są to wysoce wyspecjalizowane jednokomórkowe organizmy eukariotyczne posiadające jądro komórkowe, pasożytujące wewnątrz komórek innych eukariotów. 

Ich pozycja systematyczna zmieniała się wraz z rozwojem wiedzy na ich temat. Przez pewien czas klasyfikowane były jako pierwotniaki formujące spory (Sporozoa). W świetle obecnych badań molekularnych i filogenetycznych uważa się, że mikrosporydia są raczej blisko spokrewnione z grzybami (Keeling, 2002). 

Na infekcję podatne są ssaki oraz ptaki. Głównym żywicielem pasożyta jest królik. 

Encephalitozoon cuniculi opisany został po raz pierwszy na przykładzie młodych królików z porażeniem ruchowym, u których wywołał ziarniniakowe zapalenie mózgu. Miało to miejsce w 1922r (Wright, 1922) 

Ze względu na odmianę rybosomalnego RNA i kariotypu, E.cuniculi zostało podzielone na 3 szczepy (Schoeb, 2007) Każdy z nich ma odmiennego docelowego gospodarza. 

• Szczep I (kariotyp A,B i C) uważa się za „szczep króliczy”, był izolowany od królików, ludzi oraz myszy.
• Szczep II (Kariotyp F) uważa się za „szczep mysi” – był izolowany od dla myszy i lisów błękitnych
• Szczep III (kariotyp D i E) uważa się za „szczep psi” i był izolowany zarówno dla psów jak i dla ludzi.

Wszystkie 3 typy izolowane były od ptaków (Bednarska, 2012) 

U królików w naturalnych warunkach stwierdzano jak dotąd tylko zakażenie szczepem I, wiadomo jednak, ze są wrażliwe również na zakażenie szczepem II i III (Mathis et al. 2005) 

Spory E.Cuniculi są owalne, niewielkich rozmiarów (1,5×2,5 µm), otoczone grubą błoną komórkową. Spora ma bardzo charakterystyczną budowę wewnętrzną i jest najbardziej charakterystyczną postacią mikrosporydiów. Zawiera zwiniętą, drożną nić biegunową oraz zarodek, zwany sporoplazmą. Ma ona zdolność do przebywania poza komórką żywiciela, jest postacią dyspersyjną (rozprzestrzeniającą się), inwazyjną i diagnostyczną. 

Gdy aktywacja spory wewnątrz zaatakowanego organizmy zostanie rozpoczęta, wzrasta ciśnienie wewnętrzne, co prowadzi do pęknięcia spory i wystrzelenia obecnej w niej nici i wbicia się jej w atakowaną komórkę. Sporoplazma przeciska się przez wnętrze nici i lokuje w cytoplazmie komórki żywiciela. Tam przekształca się w mało zróżnicowanego meronta, który rozmnaża się drogą kolejnych podziałów. Meronty przekształcają się w sporonty, w których powstają sporoblasty, z których tworzą się spory. Cykl życiowy u gospodarza trwa około trzech tygodni, po tym czasie spory są uwalniane. Wydostają się do układu krążenia i tą drogą szerzą się po organizmie lub do światła kanalików nerkowych (gdzie następnie wydalane są z moczem).  

DROGI ZARAŻENIA E.CUNICULI:

Infekcja rozprzestrzenia się drogą horyzontalną (przez kontakt bezpośredni bądź zanieczyszczone środowisko).

Największa liczba spor jest wydalana z moczem bezpośrednio po zarażeniu, ale obecność spor stwierdzono także w kale i wydzielinie z dróg oddechowych. Najczęściej zarażenie następuje drogą doustną, zdecydowanie rzadziej drogą aerogenną (Gabrisch 2009, Katkiewicz 1989). 

Naturalnym sposobem zarażania się królików jest droga pokarmowa – poprzez zjadanie spor, które zostały wydalone z moczem (Suckow, 2012). 

Opisywane są również śródmaciczne zakażenie E.Cuniculi. W takim przypadku spory zasiedlają zwykle przednią torebkę soczewki. Wydaje się, że ta droga zakażenie ma znaczenie tylko w rozwoju ocznej postaci choroby (Wolfer et al. 1993). 

LOKALIZACJA W ORGANIZMIE:

Pasożyt osiedla się w komórkach glejowych, komórkach nabłonkowych kanalików nerkowych, hepatocytach, komórkach śródbłonkowych, makrofagach i monocytach. 

WYSTĘPOWANIE E.CUNICULI U KRÓLIKÓW:

U królików zarażenia E. cuniculi występują bardzo często – stopień zarażenia waha się od 5-45% w Niemczech do nawet 80% w Szwecji (Künzel F et al., 2008). W Anglii kontakt z tym microsporidium miało 52% królików (Kneeble E.J, 2009) 

OBJAWY KLINICZNE:

Zakażenie E.Cuniculi najczęściej przybiera postać chroniczną – jej rozwój zajmuje tygodnie lub nawet miesiące i może, ale wcale nie musi doprowadzić do rozwoju objawów klinicznych. W pierwszej kolejności pasożyty widoczne są w nerkach, wątrobie i płucach. W dalszej kolejności pojawiają się one w mózgu. W zaawansowanym stadium choroby najsilniejsze zmiany obserwowane są w nerkach i mózgu, natomiast w płucach i wątrobie pasożyt już raczej nie występuje. Czasem można spotkać można go również w sercu, zazwyczaj jednak w mniejszej ilości (Cox et al. 1979) 

Króliki cierpiące z powodu encephalitozoonozy mogą wykazywać objawy ze strony:

• układu nerwowego
• układu moczowego
• lub narządy wzroku.

Te trzy formy choroby mogą występować pojedynczo lub w kombinacjach. Objawy ze strony układu nerwowego wyraźnie dominują jeśli chodzi o kliniczną manifestację choroby (Kűnzel, 2010).  

▪ Układ nerwowy:  

Zmiany dotyczą najczęściej mózgu, ale ogniska zapalne mogą być widoczne również w rdzeniu kręgowym. W obrębie mózgu stwierdzane są okołonaczyniowe nacieczenia, od delikatnych zmian do ogniskowych lub wieloogniskowych ziarniniakowych zmian zapalnych mózgu. 

Objawy kliniczne pojawiają się zazwyczaj nagle . Mogą być one poprzedzone jakimś stresującym wydarzeniem w życiu królika. Najczęstszym obserwowanym objawem neurologicznym są zaburzenia przedsionkowe (Jass et al. 2008). Objawiają się one – kręczem szyi, niezbornością ruchów, kręceniem się w kółko, oczopląsem, rotacyjnymi ruchami wokół dłuższej osi ciała (rolowanie się). 

Z innych objawów neurologicznych możemy obserwować: niezborność ruchów, niedowłady tylnych kończyn, drżenia głowy, kołysanie się, kiwanie, opistotonus (objaw oponowy), napady drgawek. Konsekwencją rozwoju takich objawów może być nagła śmierć. 

Rzadko, ale zdarza się, że u chorych królików objawy choroby dotyczą zachowania – pojawić się może agresja, skakanie na pręty klatki, samookaleczenia (Harcourt-Brown and Holloway, 2003) 

▪ Układ moczowy:

Zmiany w nerkach obejmują ogniskowe ziarniniakowe zapalenie.

Większość przypadków przewlekłego zapalenia nerek będącego skutkiem zakażenia E.cuniculi przebiega subklinicznie. Przewlekła niewydolność nerek może prowadzić do rozwoju anemii, a czasem nawet osteodystrofii, mogącej objawiać się patologicznymi złamaniami w obrębie kości długich (Ewringmann 1999). Postaci nerkowej towarzyszyć mogą również – zwiększone pragnienie, zwiększona ilość oddawanego moczu, nietrzymanie moczu, chudnięcie zwierzęcia. We krwi widoczna może być azotemia. 

Zmiany w obrębie torebki nerki mogą być widoczne podczas badania USG tego narządu. 

▪ Narząd wzroku

Zmiany dotyczące gałki ocznej, obserwowane w trakcie kunikulozy to: fakolityczne zapalenie błony naczyniowej oka, zaćma – o różnym stopniu zaawansowania (Künzel 2010, Harcourt-Brown 2002), ropostek (łac. hypopyon) – czyli obecność ropy w komorze przedniej oka. 

Zmiany w gałce ocznej są efektem zakażenia śródmacicznego. Pasożyty spotykane są tylko w obrębie soczewki (Giordano et al. 2005). Dochodzi do nacieczenia soczewki komórkami zapalnymi (granulocytami, makrofagami, komórkami olbrzymimi) co prowadzi w efekcie do jej pęknięcia. 

Większość królików cierpiących z powodu ocznej postaci E.Cuniculi to osobniki młode (Künzel et al. 2008). Objawy dotyczą zazwyczaj jednego oka, ale spotykane mogą być również w obydwu (Harcourt-Brown and Holloway 2003).
Jeśli zmiany dotyczą tylko oka, samopoczucie królika jest zazwyczaj dobre, w badaniu klinicznym nie stwierdzamy innych nieprawidłowości. 

Trochę statystyki dotyczącej zmian w obrębie gałki ocznej: 

W pewnym badaniu, przeprowadzonym na grupie 144 królików z dodatnimi przeciwciałami przeciwko E.Cuniculi, 25 miało objawy ze strony oka. Z tych 25 królików – 20 miało zaćmę, 16 ropostek, 21 zapalenie błony naczyniowej. 16 królików miało wszystkie te trzy objawy równocześnie (Kunzel et al. 2008) 

DIAGNOSTYKA RÓŻNICOWA:

W przypadku objawów ze strony układu nerwowego: 

• zapalenie ucha środkowego i zewnętrznego (wywoływane najczęściej przez Pasteurella multocida). Występują objawy przedsionkowe. Mogą występować dodatkowo objawy ze strony układu oddechowego (katar, kichanie, świsty). Diagnostyka polega na pobraniu wymazu i wykonaniu zdjęcia RTG puszek bębenkowych.     

Uwaga! Bakteryjne zapalenie ucha może występować równocześnie z E.cuniculi. W jednym z badań u 57,9% królików z zapaleniem ucha stwierdzono dodatkowo przeciwciała IgM specyficzne dla E.Cuniculi, świadczące o aktywnej infekcji (Jeklovaa 2010)

• zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych na tle innych infekcji bakteryjnych – też jest to częsta przyczyna występowania objawów neurologicznych u królików (Gruber et al. 2009)
• nowotwory, które mogą dotyczyć układu nerwowego – np. chłoniak
•  urazy mechaniczne rdzenia kręgowego – prowadzące do wystąpienia niedowładu czy paraliżu
•  urazy głowy prowadzące do uszkodzenia mózgu
•  kokcydioza
• toksoplazmoza – jest to rzadka przyczyna objawów neurologicznych u królików (Künzel et al., 2008), zazwyczaj jej przebieg jest subkliniczny. W odróżnieniu od encephalitozoonozy u królików z klinicznymi objawami toksoplazmozy najczęściej obserwujemy letarg, brak apetytu, gorączkę (Dubey 1992)
• zapalenie układu nerwowego na tle infekcji wirusowych, przy zakażeniu np. herpes virusem, wiusem choroby Borna, wirusem wścieklizny – rzadko
• niedobrór wit E i selenu
• zaburzony stosunek sodu do potasu
• przyczyny metaboliczne – niedobory witamin, mikroelementów, w przebiegu chorób – takich jak np. stłuszczenie wątroby, zatrucia pokarmowe – mykotoksykozy.
• choroby kardiologiczne

W przypadku objawów ze strony nerek: 

•  w diagnostyce różnicowej przyczyn uszkodzenia nerek należy brać pod uwagę kamicę nerkową (łatwo rozróżnić ją od uszkodzenia nerek na tle E.cuniculi wykonując zdjęcia RTG lub badanie USG nerek).

W przypadku objawów ze strony oczu/oka: 

• w diagnostyce różnicowej trzeba brać pod uwagę bakteryjne zapalenie błony naczyniowej (zwykle wywołane przez P. multocida), zapalenia powstałe wtórnie do ciężkiego zapalenia rogówki, urazy z penetrującym ciałem obcym. 

DIAGNOSTYKA E.CUNICULI:

Diagnostyka E.Cuniculi u żywego zwierzęcia jest trudna. Jest jednak ważna, aby ustalić właściwe sposoby leczenie, czasem, aby ustalić ryzyko choroby odzwierzęcej u ludzi (jeśli właściciel znajduje się w grupie podwyższonego ryzyka, czyli ma mocno obniżoną odporność).

Diagnozę stawia się zazwyczaj na podstawie objawów klinicznych, wykluczeniu innych chorób dających podobne objawy, wykonaniu testów serologicznych. 

Ze względu na chroniczny przebieg choroby przeciwciała przeciw E. Cuniculi produkowane są i utrzymują się przez długi okres czasu. Wydaje się jednak, że odpowiedź immunologiczna nie jest skuteczna jeśli chodzi o ochronę przed chorobą. Zasadnicze są tu mechanizmy komórkowe (zwłaszcza limfocyty CD8⁺) – to one odgrywają główną rolę jeśli chodzi o kontrolę pasożyta i długość życia królika (Khan et al. 2001). Dlatego występowanie u królika choroby powodującej obniżenie odporności, bądź leczenie królika cytostatykami może spowodować zaostrzenie przebiegu choroby i wystąpienie klinicznych objawów encephalitozoonozy.

Jak pisałam powyżej, z wyników badań wynika, ze bardzo duża część populacji królików miała styczność z tym pasożytem (do 80%) i wytworzyła przeciwko niemu przeciwciała. Oznacza to, ze typowy test w kierunku obecności przeciwciał (wykrywający przeciwciała IgG) może służyć jedynie WYKLUCZENIU choroby (jeśli wyjdzie ujemny). Obecność przeciwciał IgG wykazuje jedynie kontakt zwierzęcia z pasożytem, nie potwierdza jednak, że jest on przyczyną występującej aktualnie u danego królika choroby – dającej objawy np. ze strony układu nerwowego (Jeklovaa et al. 2010). Co więcej – poziom przeciwciał IgG również nie może być brany pod uwagę jako czynnik pozwalający ustalić, czy przyczyną objawów choroby jest E.Cuniculi, ponieważ u dużego procenta królików poziom tych przeciwciał jest wysoki i może pozostać takim przez długie lata (Jeklova 2010)

Na podstawie samego wykrycia przeciwciał IgG przeciwko E. cuniculi nie można twierdzić, że przyczyną objawów klinicznych choroby jest E.cuniculi. Test ten wychodzi bowiem dodatnio u dużej liczby królików i nie świadczy o aktywnym procesie chorobowym. Na tej podstawie możemy tylko stwierdzić, że królik miał wcześniejszy kontakt z patogenem. U wielu klinicznie zdrowych królików można stwierdzić wysokie miana przeciwciał IgG (Harcourt-Brown 2004). Wykrycie tych przeciwciał oznacza jednak, że u takiego królika pod wpływem stresu lub innego czynnika obniżającego odporność może dojść do uaktywnienia encephalitozoonozy i przejścia choroby w aktywną fazę. Dlatego króliki, które są tylko IgG dodatnie powinny być regularnie kontrolowane, czy nie pojawiają się u nich przeciwciała IgM, które są wskazaniem do podawania leków (Jeklova et al. 2010) 

Wynik ujemny jest właściwie pewny. Tylko w kilku przypadkach można mieć co do niego wątpliwości – w sytuacjach, gdy odpowiedź immunologiczna nie zdążyła jeszcze lub nie mogła właściwie się wytworzyć. Chodzi tu o wczesne etapy infekcji, bardzo młode króliki, zwierzęta będące w stanie immunosupresji. 

Zainfekowane samice przekazują odporność bierną swoim dzieciom. Przeciwciała matczyne są wykrywane u młodych królików do wieku 4 tygodni. Później występuje okres, w którym nie wykrywa się przeciwciał. Wytwarzanie własnych przeciwciał w odpowiedzi na aktywną infekcję występuje u królików w wieku 8-10 tygodni (Lyngset 1980) 

Aby dowiedzieć się, czy niepokojące nad objawy kliniczne mogą mieć związek z encephalitozoonozą, trzeba wykonać  test, w którym oznaczamy miano przeciwciał IgG (świadczących o tym, ze królik kiedyś zetknął się z pasożytem i wytworzył przeciwciała) oraz IgM (co świadczy o świeżej infekcji). Testy w tej wersji są niestety dużo droższe niż te pierwsze, ale też ich znaczenie diagnostyczne jest znacznie większe. 

Podczas badania wykonanego w latach 2005-2009 w Czechach, na grupie 500 królików, które zgłosiły się z różnych przyczyn do Avian and Exotic Animal Clinic (Uniwersytet Medycyny Weterynaryjnej i Nauk Farmaceutycznych) w Brnie przeciwciała IgM wykryto u 32,4% badanych królików, natomiast przeciwciała IgG u 68%.

Przeciwciała IgM wykryto u 54,4% królików u których obserwowano jako objaw chorobowy objawy nerwowe (miano IgG w tej grupie wynosiło 86,1%). U królików z chorobami nerek 36,2% zwierząt miało we krwi specyficzne przeciwciała IgM, 80,9% IgG. Z królików z objawami ze strony oczu 44,4% miało przeciwciała IgM, 77,8% IgG. 

W znajdującej się pośród tych 500 królików grupie 287 zwierząt, u których występowały inne objawy chorobowe niż ze strony układu nerwowego, nerek, oka – u 26,5% stwierdzono obecność przeciwciał IgM, 65,1% IgG. Co istotne, przeciwciała IgM stwierdzono również u 24,2% królików u których nie występowały żadne kliniczne objawy jakiejkolwiek choroby. Obecność przeciwciał IgM jest dowodem na występowanie aktywnej infekcji i wskazaniem do rozpoczęcia leczenia. Ponieważ przeciwciała IgM stwierdzane były często u królików, które nie miały typowych objawów wskazujących na E.Cuniculi lub wręcz nie wykazywały żadnych objawów chorobowych, autorzy artykułu opisującego to badanie wskazują na zasadność wykonywania badań poziomu przeciwciał IgM i IgG jako część rutynowych badań przeglądowych u tego gatunku zwierząt (Jeklova et al., 2010) 

Serologia jest najlepszym narzędziem, pomagającym w przyżyciowej diagnostyce kunikulozy.  

Trudność związana z tym badaniem polega na nieregularnym wydalaniu spor. Wynik dodatni jest w tej sytuacji pewny, natomiast wynik ujemny może być fałszywy (królik wydala spory z moczem, ale akurat nie wydalał ich w momencie, gdy pobierana była próbka do badań)

BADANIE POŚMIERTNE 

Badanie histopatologiczne jest częstą metodą pośmiertnej diagnozy Kunikulozy. Widoczne są zmiany w postaci ziarniniakowego zapalenia mózgu oraz przewlekłego śródmiąższowego zapalenia nerek (Jacqueline Csokai, 2009). W badanych tkankach poprzez specjalne barwienie szuka się spor pasożyta. Infekcja wydaje się szerzyć od układu moczowego do układu nerwowego. Spory można znaleźć najpierw w nerkach (4 tygodnie od momentu wytworzenia przeciwciał) a następnie w mózgu (8 tygodni po wytworzeniu przeciwciał) (Cox ang Gallichio 1978). 

Inną metodą jest badanie PCR bioptatów tkanek. Najlepszą tkanką do badań histopatologicznych jest mózg. Drugą w kolejności są nerki. W innych narządach takich jak serce, płuca, wątroba czy śledziona spory znajdowane są jedynie sporadycznie (Jacqueline Csokai, 2009). 

LECZENIE ENCEPHALITOZOONOZY:

Leczenie E.cuniculi jest prawie tak samo problematyczne, jak diagnozowanie. Objawy kliniczne związane są nie tyle z obecnością samego pasożyta, ale z reakcją zapalną, którą wywołuje. Nawet jeśli pasożyt jest obecny w tkankach i przy pomocy leków unieszkodliwimy go, nie oznacza to, że cofną się równocześnie zmiany, które zdołał już wywołać w układzie nerwowym czy w strukturze nerek. 

Leczenie polega na podawaniu:

• leków przeciwpasożytniczych – albendazol, fenbendazol
• leków przeciwzapalnych
• leków usprawniających funkcje uszkodzonych narządów (nerki, serce, mózg)
• witamin z grupy B
• osłonowo antybiotyków

PREWENCJA:

• izolowanie zwierząt chorych od zdrowych (ponieważ chore mogą wydalać spory)
• dezynfekcja klatek, wyposażenia – gotowanie przez 5 minut niszczy spory, środki dezynfekujące takie jak 70% etanol, woda utleniona 1%, wodorotlenek sodu 1% – niszczą spory po ich 30 minutowej ekspozycji na te środki. 

W temperaturze pokojowej spory E.cuniculi mogą przeżyć co najmniej 4 tygodnie (Besch-Williford CL, 1997).  

CO DALEJ?

Wielką niewiadomą pozostaje nadal, co dzieje się w organizmie królika po przejściu aktywnej formy encephalitozoonozy. Nie wiadomo, czy i kiedy choroba uaktywni się ponownie w ciągu dalszego życia królika. 

Trudno ocenić w pełni działanie leków przeciwpasożytniczych w przypadku E.Cuniculi. Istnieją publikacje sugerujące, że pasożyta tego nie da się w pełni usunąć z tkanek (Besch-Williford CL, 1997) 

Leczenie przeciwpasożytnicze (fenbenfazolem) można powtarzać co 6 miesięcy, bądź częściej – jeśli nawrócą objawy związane z chorobą, bądź pogorszeniu ulegnie kondycja królika (Harcourt-Brown FM, 2004)